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  2. His-Tag 蛋白純化磁珠

    簡介:磁珠純化組氨酸標簽蛋白,無需對樣品進行多次長時間的高速離心和濾膜過濾、無需控制流速、更無需高昂的層析設備。樣品與磁珠的特異性結合、洗滌以及目標蛋白的洗脫變得簡單、快速、易操作。對于熟練的操作者而言,在 1h 內就能獲得高純度的目標蛋白,且能輕松實現高通量和大規模樣品的平行處理,為研究者節省了時間和成本。

    產品名稱:Beads-IDA-Ni

    螯合金屬離子:Ni2+

    磁珠含量:100 mg/mL

    蛋白結合量:30-40 μg/mg

    保存液:20%乙醇(v/v)

    適用范圍:適用于純化細菌、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞等分泌或胞內表達的可溶性組氨酸標簽蛋白,也可用于變性蛋白的純化(包涵體需變性后再進行純化)。

    操作步驟:

    1、緩沖液的準備

    目標蛋白與組氨酸標簽蛋白純化磁珠的結合性能將直接影響目標蛋白的純化效率,而各種緩沖液配制也將在一定程度上影響目標蛋白的回收率和純度。因此,在較大規模蛋白純化之前,用戶應該自行設計實驗,篩選出適合純化目標蛋白的緩沖液體系,主要包括 Binding Buffer、Washing Buffer、Elution Buffer。

    增加咪唑濃度進行洗脫是組氨酸標簽純化磁珠最常用的洗脫方法,首次使用時,在不確定最佳的洗脫咪唑濃度情況下,推薦在緩沖液中分別加入 10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM咪唑,濃度從低到高分別洗脫,磁吸后收集蛋白上清液,之后通過 SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結果。

    以下提供的緩沖液體系適用于多數組氨酸標簽蛋白的純化,供用戶參考。Binding Buffer:20mM磷酸緩沖液,0~50mM 咪唑,pH7.4;WashingBuffer:20mM磷酸緩沖液,50~100mM 咪唑,pH7.4;Elution Buffer:20mM磷酸緩沖液, 100-500mM 咪唑,pH7.4;

    2、磁珠預處理

    預估蛋白表達量,根據30-40ug/mg蛋白的結合量投入合適量的磁珠,假如預估表達量為10-20mg,那么需要投入500mg的磁珠;利用磁鐵或者磁力架去除磁珠保存液,加入保存液相同體積的Bingding Buffer清洗3次,每次上下翻轉 10-20次,去除上清液;建議磁性分離時間為30-60s。

    3、目標蛋白與磁珠的結合

    加入目標蛋白樣品(建議目標粗蛋白溶液與Binding Buffer相同,如果不同,建議使用超濾或者透析的方式進行 Buffer替換).震蕩混勻 30s,室溫或者冷藏旋轉混勻10-30分鐘(如果目標蛋白溫度穩定性差,可在冷藏條件下進行,適當增加結合時間至1-2個小時)。

    4、磁珠洗滌

    加入合適體積的Washing Buffer(建議體積為1-2mL/100mg),顛倒混勻數次,磁性分離,去除上清,重復操作3-5 次直至沒有雜蛋白出現(建議使用分光光度計OD280進行質量控制);

    5、目標蛋白洗脫

    用戶可根據需要改變洗脫體積調整目標蛋白濃度,加入合適體積的 Elution Buffer,輕輕翻轉離心管數次,使磁珠懸浮,磁性分離,收集洗脫液到新的離心管中,即為純化的目標蛋白樣品;如果需要,可以重復上述步驟 1 次,收集樣品到新的離心管中,以檢測目標蛋白是否洗脫完全。

    6、磁珠后處理

    (1)在裝有磁珠的離心管中加入 2mL/100mg的500 mM 咪唑,上下翻轉離心管數次,使磁珠懸浮,磁性分離,去除上清液。

    (2)重復上述步驟 2 次。

    (3)在離心管中加入2mL/100mg的ddH2O,上下翻轉離心管數次,使磁珠懸浮,磁性分離,去除上清液。

    (4)重復上述步驟2次。

    (5)加入 Storage Buffer 到磁珠中使總體積為 1mL/100mg,保存于 2~30℃(長期保存,置于2~8℃),可用于下一次同種蛋白的純化。

    7、磁珠再生

    磁珠連續使用三次以上,其結合目標蛋白的能力可能會明顯降低,建議進行磁珠再生處理。

    Stripping Buffer:20mM 磷酸緩沖液,500 mM NaCI,100 mM EDTA,pH7.4

    Beads Washing Buffer(可選):0.5 M NaOH,2M NaCI

    Recharge Buffer:100mM NiSO4(該化學試劑有一定的毒性,可能造成過敏反應,使用時務必注意)

    Storage Buffer:20%(v/)乙醇

    以5mL (500mg)磁珠懸液為例,詳細說明磁珠再生操作:

    (1)將磁珠懸液進行磁性分離,去除上清液,從磁性分離器上取下離心管,在離心管中加入5mL ddH2O,上下翻轉離心管數次,使磁珠重新懸浮,磁性分離,去除上清液。

    (2)加入5mL Stripping Buffer,上下翻轉離心管數次,使磁珠重新懸浮,室溫旋轉混合 5min,磁性分離,去除上清液。重復此步驟 1 次。

    (3)加入5mL ddH2O,上下翻轉離心管數次,使磁珠重新懸浮,磁性分離,去除上清液,重復此步驟 2 次。

    (4)堿處理:加入5mL Beads Washing Buffer,上下翻轉離心管數次,使磁珠重新懸浮,室溫旋轉混合 5min,磁性分離,去除上清液。加入 5mLddH2O,上下翻轉離心管數次,使磁珠重新懸浮,磁性分離,去除上清液。重復ddH2O 洗滌步驟 3~5 次,至洗滌液呈中性為止。

    (5)加入 5mL Recharge Buffer,上下翻轉離心管數次,使磁珠重新懸浮,室溫旋轉混合 20min,磁性分離,去除上清液。

    (6)加入5mL ddH2O,上下翻轉離心管數次,使磁珠重新懸浮,磁性分離,去除上清液。重復此步驟 6次以上,保證鎳離子去除完全。

    (7)加入 Storage Buffer 到磁珠中使總體積為5mL,保存于2~30℃(長期保存,置于2~8℃)。

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